Неовир

Влияние индуктора интерферона неовира на чувствительность MDR1- и MDR1+ клеток к противоопухолевым лекарствам

Влияние индуктора интерферона неовира на чувствительность MDR1- и MDR1+ клеток к противоопухолевым лекарствам

 

Черткова А.И., Славина Е.Г., Лейпунская И.Л., Кадагидзе З.Г.

 

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Москва

 

Введение

 

Химиотерапия, являющаяся основным методом лечения при злокачественных опухолях, осложненных метастазами, оказывается эффективной и обеспечивает значительное увеличение продолжительности жизни больных лишь в небольшом проценте случаев. Большинство метастатических вариантов рака или резистентны к химиотерапии, или становятся таковыми в процессе лечения [1, 2, 3, 4]. Резистентность к химиопрепаратам может развиваться на разных этапах взаимодействия веществ с клеткой. Примером резистентности, возникающей до взаимодействия агента с внутриклеточной мишенью на уровне клеточной мембраны, является так называемая множественная лекарственная устойчивость. Множественная лекарственная устойчивость – термин, используемый для обозначения резистентности опухолевых клеток к структурно и функционально несвязанным гидрофобным веществам, которая приобретается клеткой после воздействия какого-либо одного из таких агентов. Эта резистентность, как правило, связана с гиперэкспрессией гена MDR1, который кодирует мембранный Р-гликопротеин (Pgp) с молекулярной массой 170 kDa. Pgp снижает внутриклеточную концентрацию своих субстратов путем их энергозависимого выброса из клетки. Этот механизм обуславливает резистентность клетки к широкому спектру соединений, включая Vinca алколоиды, колхицин, таксол, антрациклины и актиномицин D, поддерживая концентрацию этих агентов в клетке ниже той, которая необходима для проявления цитотоксичности [1, 4, 5, 6, 7]. В настоящей работе было проведено изучение способности низкомолекулярного индуктора интерферона неовира изменять чувствительность НТ-29 и К-562 клеток, интактных и трансформированных геном MDR1, к цитотоксическому действию противоопухолевых лекарств.

 

Материалы и методы

 

Клеточные культуры

 

К-562 (клетки эритролейкемии человека), НТ-29 (клетки аденокарциномы толстого кишечника человека), интактные и трансформированные геном множественной лекарственной устойчивости MDR1. Клетки К-562 MDR1 были получены от профессора И. Ронинсона (Иллинойский университет, Чикаго, США). Клетки НТ-29 MDR1 были получены Е.Г. Славиной трансфекцией ретровирусной конструкцией с геном MDR1 и последующей селекцией культивированием в присутствии возрастающих доз винкристина с помощью сотрудников лаборатории молекулярной генетики (руководитель профессор А.В. Гудков) в том же университете. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (К-562), и DMEM (НТ-29) (обе среды производства института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO), 2mM L-глютамина и 80 мг/ л гентамицина.

 

Изучение цитотоксического действия препаратов

 

Клетки рассеивали в 96-луночные плоскодонные (НТ-29) или круглодонные (К-562) планшеты (Costar) в количестве 104клеток/ мл по 100 или по 200 мкл/ лунку. Клетки НТ-29 выращивали в термостате при 370С в атмосфере 5% СО2 24 часа, после чего ростовую среду заменяли раствором неовира в культуральной среде в концентрациях 10, 0,1 и 0, 001 мг/ мл и инкубировали клетки в термостате еще 24 часа. Клетки К-562 засевали в лунки планшет одновременно с неовиром. После 24-часовой инкубации клеток в растворе неовира препарат удаляли и заменяли раствором доксорубицина, винкристина (оба препарата производства Teva, Израиль) или 5-фторурацила (5-ФУ) (Lemery, Мексика). Через 48 часов определяли цитотоксический эффект препаратов, используя высокочувствительный колориметрический метод (МТТ-тест) [8]. Оптическую плотность (ОП) образцов измеряли на спектрофотометре Multiscan Reader MR700 (Dynatech, UK). Процент цитотоксичности определяли по формуле 100 – (среднее значение ОП в опыте/ среднее значение ОП в контроле *100). 50% цитотоксическую дозу (ЦД50) определяли регрессионным анализом по программе Sigma Plot for Windows (Jandel Sciontific, USA).

 

Статистический анализ

 

Статический анализ цитотоксической активности проводили по t-критерию Стъюдента, а средних значений ЦД50 – с использованием U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

 

Результаты

 

В наших опытах 50%-я цитотоксическая доза (ЦД50) доксорубицина для клеток НТ-29 составляла в среднем 17,7+5,8 мкг/ мл, а для клеток НТ-29 MDR1 98,7+35,96 мкг/ мл. Для клеток К-562 и К-562 MDR1 ЦД50 составила 3,5 и 15,0 мкг/ мл, соответственно. Неовир в концентрации 10 мг/ мл обладал прямым, хотя и не постоянным, цитотоксическим действием в отношении клеток (цитотоксическая активность в разных опытах колебалась от 0% до 36,5%). В концентрации 0,1 мкг/ мл его токсичность была минимальной (до 10%), а при концентрации 0,001 мг/ мл полностью отсутствовала. Неовир повышал чувствительность клеток всех использованных линий к цитотоксическому действию доксорубицина и винкристина. Степень усиления токсичности зависела как от концентрации неовира, так и от концентрации химиопрепаратов, а также от линии клеток. Наиболее выраженным эффектом обладал неовир в концентрации 10 мг/ мл. Предварительная обработка клеток НТ-29 и НТ-29 MDR1 неовиром в этой концентрации усиливала цитотоксический эффект доксорубицина, использованного в концентрациях 10; 1; 0,1; 0,01 и 0,001 мкг/ мл, но не 100 мкг/ мл. Усиление токсического действия доксорубицина в отношении клеток НТ-29 носило, как правило, аддитивный характер, а в отношении клеток НТ-29 MDR1 в большинстве случаев взаимодействие препаратов было синергистическим. ЦД50 доксорубицина при этом уменьшалась в 2,85 раза для клеток НТ-29 и в 8,67 раза для клеток НТ-29 MDR1. Неовир в концентрациях 0,1 0,001 мг/ мл лишь в одном опыте из трех незначительно повышал цитотоксическое действие 10 и 1 мкг/ мл доксорубицина на клетки НТ-29. В отношении клеток НТ-29 MDR1 эффект неовира в разных опытах колебался от незначительного повышения токсического действия доксорубицина до его уменьшения. Предварительная обработка клеток НТ-29 и НТ-29 MDR1 неовиром в концентрации 10 мг/ мл повышала также их чувствительность к винкристину при всех использованных концентрациях последнего (Таблица 1).

 

Таблица 1. Модуляция неовиром чувствительности MDR1- и MDR1+ клеток к винкристину

 

Винкристин
(мг/ мл)

Линии клеток

НТ-29

MDR1+ НТ-29

К-562

MDR1+ К-562

Δ (%)*

Δ (%)*

Δ (%)*

Δ (%)*

10,0

30,6**

32,4

14,4

44,0**

1,0

29,8**

35,1

14,1

42,0**

0,1

35,1**

41,9**

23,5

50,5**

0,01

28,9

26,3

30,7

56,0**

0,001

35,0**

25,4

23,6

41,0**

* - средний % цитотоксичности в группе «винкристин+неовир» – средний % цитотоксичности в группе «винкристин»;
** - P < 0,05

 

Наибольшее усиление токсичности винкристина в отношении клеток НТ-29 наблюдалось при использовании его в концентрациях 0,001 и 0,1 мкг/ мл, а в отношении клеток НТ-29 MDR1 – в концентрации 0,1 мкг/ мл. Эффект усиления токсичности препарата не зависел от экспрессии гена MDR1. Взаимодействие препаратов в большинстве случаев было синергестическим. В среднем токсичность неовира в этих опытах составляла 20,5+8,08% для клеток НТ-29 и 18,1+10,6% для клеток НТ-29 MDR1. Неовир в дозе 0,1 и 0,001 мг/ мл также повышал токсическую активность винкристина в отношении клеток обеих линий, однако этот эффект был непостоянным, наблюдался не при всех дозах винкристина, а в некоторых случаях отмечалось даже некоторое снижение токсичности препарата. Способность неовира повышать чувствительность клеток цитотоксическому действию химиопрепаратов проявилась и в опытах на клетках линий К-562 и К-562 MDR1. В концентрации 10 мг/ мл он в 3,18 раза повышал чувствительность клеток К-562 и более чем в 100 раз клеток К-562 MDR1 к доксорубицину. Неовир повышал также чувствительность клеток К-562 и К-562 MDR1 к винкристину, однако, это повышение было достоверным только в отношении клеток К-562 MDR1 (Таблица 1). Опыты по изучению влияния неовира на токсическую активность 5-фторурацила, не являющегося субстратом Pgp, показали, что клетки НТ-29 MDR1 были значительно более чувствительны к цитотоксическому действию этого препарата, чем клетки НТ-29. Неовир в концентрации 10 мг/ мл усиливал токсическое действие препарата в отношении клеток обеих линий, хотя более эффективно в случае клеток НТ-29. Предварительная инкубация клеток НТ-29 с неовиром приводила к снижению ЦД50 5-фторурацила в 2000 раз, и клеток НТ-29 MDR1 – в 36,6 раза.

 

Обсуждение

 

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы. Неовир повышает чувствительность клеток как с MDR1-, так и с MDR1+ фенотипом к цитотоксическому действию доксорубицина и винкристина, причем этот эффект во многих случаях в большей степени выражен в отношении клеток резистентной линии. Неовир эффективно усиливает цитотоксическое действие 5-фторурацила, накопление которого не зависит от экспрессии Pgp, в отношении клеток и чувствительной и резистентной линий. Неовир – натриевая соль 10-метиленкарбоксилат-9-акридона, является высокоэффективным низкомолекулярным индуктором интерферона, в особенности ИФН-a [9, 10]. Имеются многочисленные данные о том, что ИФН в условиях in vitro способен повышать противоопухолевую активность различных химиопрепаратов [11]. Показана также антипролиферативная активность ИФН-a и -g в отношении линий клеток с MDR1 фенотипом [12] и способность ИФН-a усиливать модулирующую активность моноклональных антител, направленных против Pgp in vitro и повышать противоопухолевый эффект этих антител in vivo [13]. Ранее мы установили, что a-интерферон в концентрации 20 и 200 МЕ/ мл при воздействии на клетки одновременно с препаратом, усиливал цитотоксическое действие доксорубицина, винкристина, а также 5-фторурацила в отношении клеток и с MDR1- и с MDR1+ фенотипом [14]. В наших опытах взаимодействие неовира с химиопрепаратами носило как аддитивный, так и синергистический характер. Можно предположить, что эффект усиления токсической активности лекарств неовиром связан как с непосредственной суммацией эффектов двух последовательно взаимодействующих препаратов, так и с влиянием неовира на какие-то клеточные структуры и/ или функции, результатом которого является повышение чувствительности клеток к последующему воздействию химиопрепарата. Эффект неовира, по-видимому, не связан с воздействием на механизмы множественной лекарственной устойчивости и обусловлен какими-то другими причинами.

 

Литература

 

1. Делекторский В.В., Малиновская В.В., Стрижаков А.Н., Яшкова Г.Н., Каграманова Ж.А. и соавт. Неовир (Камедон), индуктор интерферона в комплексном лечении хронических воспалительных заболеваний придатков матки хламидийной этиологии (клинико-электронномикроскопическое исследование). Антибиотики и Химиотерапия, 1995. – Т. 40 (5). – С. 42-47.

 

2. Gottesman M.M. Molecular basis of therapy. J. Natl. Cancer Inst. 1994. – V. 86. – P. 1277-1285.

 

3. Satta T., Isobe K., Yamauchi M., Nakashima J. et al. Establishment of drug resistance in human gastric and colon carcinoma xenograft lines. Jpn. J. Cancer Res. 1991. – V. 82. – P. 593-598.

 

4. Chowdhary S.A., List A.F., Drug resistance: overview of mechanisms. Encyclopedia of Cancer 1997. – V. 1. – P. 610-620.

 

5. Gottesman M.M., Pastan J. Biochemistry of multidrug resistance mediated by multidrug transporter. Annu. Rev. Biochem. 1993. – V. 62. – P. 385-427.

 

6. Roninson J.B. Multidrug resistance. Encyclopedia of Cancer 1997. – V. 2. – P. 1095-1107.

 

7. Laing N.M., Tew K.D. Drug resistance to chemotherapy: mechanisms. Encyclopedia of Cancer 1997. – V. 1. – P. 560-570.

 

8. Jaffrezou J-P., Levade Th., Chatelain P., Laurent G. Modulation of subcellular distribution of doxorubicin in mulidrug-resistant P388/ ADR mouse leukemia cells by the chemosensitizer í(2-Isopropyl-1-í4-[3-N-methyl-N-(3,4-dimethoxy-b-phenethyl) amino] propyloxyý-Benzenesulfonylýý indolizine. Cancer Res. 1992. – V. 52. – P. 6440-6446.

 

9. Carmichael J., DeGraff W.G., Gazdar A.F. et al. Evaluation of a tetrazolium-bazed semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res. 1987. – V. 47. – P. 936-942.

 

10. Sergeev A.Y., Sergeev Y.V. Neovir: the new super-inducer of endogenous interferon on treatment of resistant forms of urogenital chlamidiosis. J. EADF 1996. – V. 7. – P. 197.

 

11. Wadler S., Schwartz E.L. Antineoplastic activity of the combination of interferon and cytotoxic agents against experimental and human malignancies: a review. Cancer Res. 1990. – V. 50. – P. 3347-3348.

 

12. Reddy P.G., Graham G.M., Datta S. et al. Effect of recombinant fibroblast interferon and recombinant immune interferon on growth and the antigenic phenotype of multidrug-resistant human glioblastoma multiforme cells. J. Natl. Cancer Inst. 1991. – V. 83. – P. 1307-1315.

 

13. Fogler W.E., Pearson J.W., Volker K. et al. Enhancement by recombinant human interferon-alpha of the reversal of multidrug resistance by MRK-16 monoclonal antibody. J. Natl. Cancer Inst. 1995. – V. 87. – P.94-103.

 

14. Slavina E.G., Zabotina T.N., Dzgamadze N.T., Leipunskaya I.L., Kadagidze Z.G. Enhancement of the growth inhibiting action of the human colon carcinoma cells by recombinant a-interferon. 8th Intern. Congress of Anticancer Treat. 1998. – P.192.

 

Статья опубликована - Russian Journal of Immunology 2000. – V. 5. – N. 4. – P. 385-390.

Неовир индуктор выработки эндогенного интерферона,  с  широким диапазоном противовирусной и иммуномодулирующей активности при терапии вирусных, бактериальных и  грибковых  заболеваний.

Для просмотра более подробной информации по препарату, пожалуйста подтвердите, что Вы являетесь медицинским специалистом:

GFMG © 2014г Украина (044) 239-26-41